Las Empresas Operadoras son las encargadas de comprar y operar los buses troncales que actualmente están en los corredores de Fase I (Calle 80, Av. Caracas, Autopista Norte y Calle 13), Fase II (Américas, NQS y Suba) y Fase III (Calle 26 y Carrera 10ª). Adicionalmente, se encargan de contratar y capacitar los conductores del Sistema. Con el fin de maximizar la eficiencia y la cobertura del TransMilenio, el Sistema de operación incluye servicios troncales y servicios alimentadores. Los servicios son provistos por empresas privadas, bajo estrictas condiciones establecidas en contratos de concesión otorgados por TRANSMILENIO S.A., y de conformidad con un control centralizado. A continuación se describen los componentes del sistema de operación de TransMilenio:

Los vehículos que se utilizan en los servicios troncales del Sistema TransMilenio son especialmente diseñados para el transporte público urbano de pasajeros. Tienen una capacidad para 160 personas, mide 18 metros de largo por 2.60 de ancho y cuentan con características mecánicas avanzadas: suspensión neumática, caja de cambios automática, cuatro (4) puertas de 1.10 metros al lado izquierdo y motores de última tecnología alimentados por Diésel, los cuales superan ampliamente las normas medioambientales vigentes en Colombia. Los vehículos del Sistema TransMilenio ofrecen estándares de calidad y servicio mucho mejor que los del transporte tradicional.

Adicionalmente, en el segundo semestre de 2009 se hizo la vinculación de flota con mayor capacidad (buses biarticulados), tiene una capacidad 260 personas, mide 27.2 metros de largo por 2.60 de ancho y cuentan con características mecánicas avanzadas: suspensión neumática, caja de cambios automática, siete (7) puertas de 1.10 metros al lado izquierdo y motores de última tecnología alimentados por Diésel.

La puesta en operación  de estos vehículos permite atender los corredores con mayor demanda mejorando los tiempos de atención de los usuarios en las estaciones con mayor afluencia. Entre las ventajas del bus  BiarticuladoPalabra con contexto: Bus de alta capacidad que cuenta con tres (3) cuerpos o vagones y dos (2) articulaciones. La capacidad de los buses puede ser de hasta doscientos cincuenta (250) pasajeros, dependiendo de su configuración pueden tener una longitud de hasta veintiocho (28) metros de largo y su peso debe cumplir con lo establecido en la Norma Técnica ICONTEC NTC 4901-01 actualizada. se encuentran: mayor capacidad de abordaje de los usuarios, mejor distribución de los usuarios dentro de la estación, menor cantidad de emisiones por pasajero transportado. Existen varios factores que hacen atractivo el uso de los autobuses biarticulados, tales como su mayor productividad laboral, la cual reduce los costos de operación por usuario reflejado en la tarifa.